1、儀器質(zhì)控
為使儀器保持*工作狀態(tài),應(yīng)建立維護(hù)和校正儀器的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP),所要控制的儀器包括移液器(加樣槍?zhuān)?、溫箱、洗板機(jī)和酶標(biāo)儀。
◎移液器: ELISA試劑盒加樣量?。?0-200μl),其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,利用稱(chēng)重法檢查:低、中、高三個(gè)刻度分別吸取指示量的水,萬(wàn)分之一天平稱(chēng)重后計(jì)算吸量是否準(zhǔn)確,一般應(yīng)在±5%以?xún)?nèi);
◎恒溫箱: 經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計(jì)所示的溫度和水中(或溫箱內(nèi))實(shí)測(cè)溫度是否一致,允許有±1℃的誤差;
◎洗板機(jī): 每個(gè)設(shè)置洗板后的殘留液有各自的規(guī)定,一般不超過(guò)2μl;人工扣板時(shí),墊紙不濕;定期檢查管孔是否堵塞;
◎酶標(biāo)儀:經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分,防止濾光片霉變,定期檢測(cè)校正,使其保持良好的工作性能。
2、試劑盒選擇
◎應(yīng)盡量選擇正規(guī),產(chǎn)品經(jīng)相應(yīng)政府部門(mén)審核認(rèn)可,試劑應(yīng)從靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡(jiǎn)便性、安全性及經(jīng)濟(jì)性全面評(píng)價(jià)。
◎靈敏度:有二層含義,1)為試劑檢出被檢物質(zhì)的zui低量的能力;2)為試劑對(duì)大量樣品中陽(yáng)性檢出的能力。
◎特異性:常用交叉反應(yīng)率表示。含有與待測(cè)物相近結(jié)構(gòu)部份的物質(zhì)可能存在交叉反應(yīng),使測(cè)定結(jié)果升 高,可能導(dǎo)致假陽(yáng)性,所以交叉反應(yīng)是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。
◎精密度:ELISA試劑盒一般指其批內(nèi)CV%,其值應(yīng)小于15%;定量試劑應(yīng)同時(shí)考察線(xiàn)性范圍。
◎準(zhǔn)確度:通過(guò)添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
◎簡(jiǎn)便性:指在不影響試劑的前三項(xiàng)指標(biāo)的前題下,實(shí)驗(yàn)和測(cè)定步驟越少越好,在定性實(shí)驗(yàn)中結(jié)果判斷簡(jiǎn)單明了,定量試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算也應(yīng)簡(jiǎn)單。
◎安全性:指試劑對(duì)操作者和環(huán)境安全無(wú)害無(wú)傳染性。
◎經(jīng)濟(jì)性:試劑在同等質(zhì)量條件下通過(guò)大規(guī)?;蚣夹g(shù)進(jìn)步降低成本,而市場(chǎng)價(jià)格比較合理。
◎試劑評(píng)價(jià):需要有的確證方法和確證的樣品進(jìn)行檢測(cè)。
3、樣本前處理注意事項(xiàng)
3.1 均質(zhì)
組織樣本:肉、肝食品類(lèi)切細(xì),用絞肉機(jī)反復(fù)絞碎,混合均勻。
水產(chǎn)樣本:去除樣品的非食用部分,食用部分切細(xì),用均質(zhì)器均漿;原料表面較臟時(shí),需適當(dāng)用蒸餾水清洗。
蛋類(lèi):鮮蛋去殼,蛋黃和蛋白充分混勻。
水果、蔬菜類(lèi):先用水洗去泥沙,然后除去表面的水分,取食用部分。
3.2 振蕩提取
將提取溶劑加入到裝有樣品的具塞容器中,振蕩,使提取溶劑與容器內(nèi)的樣品充分接觸以深入到樣本組織內(nèi)部,提取待測(cè)組分。
3.2.1振蕩方式:振蕩器上進(jìn)行上下、往返式振蕩、手搖式上下振蕩。
3.2.2 在組織樣本中加入有機(jī)溶劑之間提取時(shí),應(yīng)邊加邊振蕩,防止組織凝結(jié)成團(tuán),不利于提取。
3.3. 在用有機(jī)溶劑提取過(guò)程中,如果出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,解決的方法有:①用細(xì)頭輕輕的攪拌,破壞乳化后,再重復(fù)離心。②再加入適量的提取劑,重新振蕩。注意離心后要保證樣本的稀釋倍數(shù)不變。
3.4 濃縮
由于凈化過(guò)程中引入的溶劑,可能會(huì)降低待測(cè)組分的濃度或者不適宜直接分析,需要去除全部有機(jī)溶劑。即試劑盒前處理步驟中把樣本在60℃氮?dú)庀麓蹈?,再用?fù)溶液溶解干燥殘留物。
濃縮方式:
ELISA試劑盒氮?dú)獯蹈沙s、壓縮空氣吹干除雜。
注意:
3.4.1在吹干樣本之前,用甲醇清洗針頭,防止雜質(zhì)干擾。
3.4.2在吹樣本時(shí),針頭應(yīng)在液面上空,避免與樣本接觸,防止產(chǎn)生交叉污染。
3.4.3樣本吹干后應(yīng)立即取下,避免吹的時(shí)間過(guò)長(zhǎng),影響zui終檢測(cè)結(jié)果。
3.4.4不同的藥物,吹干后樣本的保質(zhì)期不同,提倡待樣本回到室溫后立即復(fù)溶。
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